ELISA試劑盒實(shí)驗過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題剖析

　　1、標曲和樣本均不顯色

　　在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充沛接觸，導致顯色偏弱。

　　推薦孵育階段，運用ELISA的微孔板振蕩器，調至適宜的頻率，使抗原抗體充沛接觸，保證結合作用。假如排除上述原因，有可能是漏加了某個(gè)組分，如檢測抗體、酶等。關(guān)于比較大意的新手，必定要做好符號和記錄，或者運用增加染料的ELISA試劑盒。

　　2、標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色

　　溶解規范品以及倍比稀釋時(shí)，未渦旋震動(dòng)或不行充沛。

　　規范品溶解、倍比稀釋時(shí)均需求渦旋震動(dòng)以保證充沛混勻。單純依托移液器重復吹打，效率較低、作用也不必定jia。

　　3、標曲顯色，樣本不顯色

　　當樣本中意圖蛋白濃度極低或者樣本中攪擾要素較強，就無(wú)法檢測到。現在ELISA仍然是蛋白檢測活絡(luò )度gao的辦法，與不同技能結合后，衍生出了多種類(lèi)型的ELISA，提高了檢測活絡(luò )度。

　　關(guān)于意圖蛋白濃度特別低的樣本，能夠嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著(zhù)必定能檢測到樣本濃度，只能說(shuō)能夠提高樣本的可測率，并使成果愈加牢靠。因為通常用一般ELISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標曲范圍內，得到的數值也愈加可信。

　　4、本底偏高，樣本值測不到標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(關(guān)于高敏ELISA能夠恰當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時(shí)分，本底過(guò)高會(huì )掩蓋意圖信號，導致無(wú)法測到樣本值。

　　在參加TMB顯色后，需實(shí)時(shí)觀(guān)察標曲顯se狀況。通常在S5孔有肉眼可見(jiàn)的微弱藍色，即可停止反應。

　　5、標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大

　　這個(gè)問(wèn)題就跟移液器和試驗者的操作有關(guān)了。移液器的運用維護不規范，就會(huì )造成移液的誤差較大；試驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。

　　掌握移液器的正確運用和維護。關(guān)于個(gè)人的操作可操練移液動(dòng)作、加快速度，保證移液的精密度。

　　6、不同試劑盒中的組分能否通用

　　除非是共用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，乃至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包含規范品、規范品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的，假如輕率運用其它試劑盒的組分，有可能對成果產(chǎn)生影響。

　　7、樣本經(jīng)不同梯度稀釋?zhuān)怂愕玫降臉颖局挡町愝^大

　　有時(shí)分咱們不清楚樣本中意圖蛋白的濃度怎么，應該怎么稀釋?zhuān)敲丛蹅兙蜁?huì )做下預試驗，確認稀釋倍數。但是有時(shí)分同一樣本做了幾個(gè)不同梯度稀釋后，核算得到的樣本值之間差異較大，應該挑選哪一個(gè)稀釋倍數呢？

　　這里觸及到了基質(zhì)效應。通常血清樣本加樣量較高時(shí)，血清中的各種蛋白會(huì )抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應較顯著(zhù)。而經(jīng)過(guò)稀釋后，攪擾要素也隨之稀釋?zhuān)绊懢蜁?huì )較小。當某兩個(gè)梯度稀釋后，核算得到的樣本值挨近時(shí)，咱們就能夠以為在該稀釋梯度時(shí)，樣本中的攪擾要素影響較小，核算得到的值也是挨近真實(shí)的。但是這樣的稀釋是針對意圖蛋白濃度較高的樣本而言。