鮑球狀病毒PCR檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)

特點(diǎn)優(yōu)勢：

    1.   特異性：所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過(guò)詳盡的生物信息學(xué)分析，經(jīng)過(guò)GenBank及自建龐大數據庫的比對，確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區段，可實(shí)現對細菌種屬及血清型的特異檢測，特異性均達到*。

    2.   重現性：該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗菌株的驗證，重現性為*。

    3.   靈敏性：該系列產(chǎn)品可實(shí)現對檢測菌的高靈敏檢測，當樣品中細菌的濃度達到103cfu/ml時(shí)，可實(shí)現對其的直接檢測，無(wú)需繁瑣的增菌過(guò)程。

    4.   實(shí)用性：檢測范圍廣，涵蓋了對人體危害較為嚴重的17種呼吸道及腸道致病菌，可實(shí)現對臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測，整個(gè)檢測過(guò)程為3-4個(gè)小時(shí)。

    5.   優(yōu)勢1：序列資源豐富，除GenBank公布的序列外，公司還進(jìn)行了大量菌株的序列破譯，從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。

    6.   優(yōu)勢2：該系列試劑盒均經(jīng)過(guò)大量的保守性及特異性實(shí)驗驗證，憑借公司擁有的豐富的菌種資源，每一種檢測試劑盒均經(jīng)過(guò)了20余種標準菌株和臨床菌株的保守性驗證及40余種近緣標準菌株和臨床菌株的特異性驗證，確保在使用過(guò)程中不會(huì )出現任何的假陽(yáng)性及假陰性報告結果。

  鮑球狀病毒PCR檢測試劑盒PCR使用方法：

一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數核酸純化產(chǎn)品兼容。

2. 如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽(yáng)性對照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的 DNA 釋放劑試用裝。則按下面步驟操作： 

3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足夠 10 個(gè)樣品）為例：在一干凈塑料

管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水，充分混合均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置，但最好在一周內用完，不要長(cháng)期放置。一次檢測一個(gè)樣品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個(gè)樣品。如果待測樣品數量為其他數字，

配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應的調整。

4. 在標記好的 N+2 個(gè)離心管中，加入 1-5mg 固體樣品（半粒芝麻大小，如奶酪）或5uL 液體樣品（如牛奶）待測樣品。在樣品制備陽(yáng)性對照中加入 5uL 陽(yáng)性對照，在樣品制備陰性對照中加入 5uL 水。

5. 在每個(gè)管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣品則震蕩混勻。

6. 95℃保溫 10 分鐘。

7. 待冷卻到常溫后加入 10uL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液。每個(gè)樣品得到的 DNA釋放液足夠進(jìn)行 50-100 次 PCR。

  鮑球狀病毒PCR檢測試劑盒實(shí)驗規則：

1、要保證移液槍的準確性，誤差不能超過(guò)2%?？捎盟碗娮犹炱竭M(jìn)行確定。但有專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行矯正。

2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標準品時(shí)。

3、要在實(shí)驗前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復到室溫，以使結果更穩定。

4、實(shí)驗時(shí)，要使底物避光保存。

5、用槍吸取液體時(shí)速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準確。

6、吸取液體時(shí)，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。

7、將液體加到酶標孔中時(shí)，避免槍頭和孔內液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會(huì )自然流下去。

8、液體全部加完后，可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)30秒，混勻液體。也可以用酶標儀的晃動(dòng)功能。

9、應盡量做雙孔實(shí)驗，這樣才能保證數據的準確性。

10、對結果有疑問(wèn)的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。

PCR反應流程常規程序

將PCR反應所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(gè)循環(huán)。重復這樣的循環(huán)25～35次，使擴增的DNA片段大量累積。最后，在72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。

2．復性（退火）和延伸溫度

復性的溫度是PCR擴增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數設定為72℃。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度，變成二步法PCR。

3．反應時(shí)間

變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細胞做模板，變性時(shí)間可適當延長(cháng)。復性時(shí)間有30秒種一般是足夠的。延伸時(shí)間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來(lái)保證充足的時(shí)間。

4．循環(huán)次數

循環(huán)次數主要與模板的起始數量有關(guān)，在模板拷貝數為104～105數量級時(shí)，循環(huán)數通常為25～35次。

平臺效應（plateaueffect）：PCR擴增過(guò)程后期會(huì )出現的產(chǎn)物的積累按減弱的指數速率增長(cháng)的現象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì )出現末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現非特異性競爭作用，擴增產(chǎn)物自身復性，高濃度擴增產(chǎn)物變性不*。

5．PCR反應液的配制

PCR反應體系的配置方式有時(shí)也會(huì )影響反應的正常進(jìn)行。常規方法與其它酶學(xué)反應一樣，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒(méi)有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。

對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時(shí)，有時(shí)會(huì )擴增不出產(chǎn)物。在遇到這個(gè)問(wèn)題時(shí)，如果將反應成分分開(kāi)配制，A管含模板、引物和dNTP，以及調整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來(lái)，可較好地克服這個(gè)問(wèn)題。

按照常規的方法配制反應體系，有時(shí)會(huì )出現非特異性擴增的問(wèn)題。熱啟動(dòng)（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問(wèn)題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當PCR反應進(jìn)入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應成分才會(huì )混合在一起。

  鮑球狀病毒PCR檢測試劑盒實(shí)驗注意事項：

1）RT-PCR可以檢測組織、細胞、血液、細菌等很多材料，不同的樣本有不同要求，實(shí)驗前請充分溝通確認實(shí)驗方案和樣本情況；

2）客戶(hù)盡可能提供實(shí)驗的背景信息、物種、基因準確的名稱(chēng)和ID號；

3）客戶(hù)盡量不要提供DNA或RNA樣品。

4）樣本保存于液氮或干冰，也可以保存于Trizol液中。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，*通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類(lèi)和非探針類(lèi)兩類(lèi)，探針類(lèi)是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來(lái)指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類(lèi)是利用熒光染料或者特異性設計的引物來(lái)指示擴增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量（包括*定量和相對定量）和定性分析。

主要服務(wù)：DNA或RNA的*定量分析、基因表達差異分析、基因分型。

主要技術(shù)：引物設計、RNA提取、cDNA合成、qPCR。

  鮑球狀病毒PCR檢測試劑盒試劑使用須知：

（1）請參照相關(guān)法規、文獻、MSDS等信息，理解并掌握好試劑的特性，再進(jìn)行安全操作。產(chǎn)品僅用于科研

（2）通常購買(mǎi)試劑時(shí)一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的話(huà)，更加注意其他保管和管理。

（3）萬(wàn)一試劑操作者并非專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員。必須在專(zhuān)業(yè)人士的指導監督下進(jìn)行操作。對于使用后的廢棄物，不要或者舊的試劑，應按照相關(guān)法律法規正當處理。

（4）購買(mǎi)后，請務(wù)必確認標簽上的注意事項；做好預防顛倒，摔壞的措施和管理體制；在使用前再次確認標簽上的注意事項，做好必要的安全對策；對沒(méi)有標明其危害特性、有害特性的，也要慎重地進(jìn)行操作；必須帶好防護用具，小心翼翼進(jìn)行操作。